On the effects of Streptococcal NAD+-glycohydrolase and Streptolysin O on macrophages

The human pathogen Streptococcus pyogenes (GAS) causes both superficial infections, such as strep throat, and invasive infections, such as necrotizing fasciitis, and is responsible for about half a million deaths each year. The number of GAS infections have increased since the 1980’s, due to the emergence of a M1T1 strain that has become widely disseminated. Increased expression of Streptolysin O (SLO) and NAD+-glycohydrolase (NADase) has been correlated with the emergence of this strain. This thesis has focused on how these two virulence factors affect cytokine release from macrophages, an innate immune cell important for the host’s defense against GAS.

In Paper I we describe a novel function for NADase: inhibition of IL-1B release after NLRP3 inflammasome activation. This inhibitory effect was mediated by extracellularly located NADase, which represents a novel functional niche for this enzyme.

In Paper II, we explore this effect further and show that NADase inhibits an unconventional IL-1B release pathway that is dependent on the P2X7 receptor and membrane permeabilization. Interestingly, we see that IL-1B release in response to GAS is independent of the pore-forming protein GSDMD.

In Paper III we show that pro-IL-1B is ubiquitinated and degraded during GAS infection. Pro-IL-1B ubiquitination requires the presence of SLO and results in heterotypic linkage types. The broad PI3K inhibitor 3-MA rescues pro-IL-1B degradation.

Paper IV focuses on NADase and the observation that NADase binds macrophages in the absence of SLO, in contrast to what has been shown previously. Recombinant NADase binds macrophages in the absence of other bacterial proteins and induces cytokine release that requires TLR4 and CD14 and is dependent on MyD88 and TRIF.

Vårt immunförsvar står inför många olika prövningar varje dag: det måste inte bara kunna göra skillnad på kroppens egna celler och inkräktare, utan behöver också kunna skilja på mikroorganismer som är våra ofarliga hyresgäster och de som har potential att orsaka sjukdomar. När våra barriärer rämnar behövs patrullerande soldater som är redo att slåss och slå larm vid första anblick av hot, men för att lösa konflikterna behövs också en trupp agenter som är specialtränade för varje fall. Vår kropp har löst detta genom att dela upp immunförsvaret i två delar: det medfödda och det adaptiva. Cellerna som tillhör det medfödda immunförsvaret har tränats för att känna igen varningssignaler gemensamma för många olika sorters bakterier och virus, vilket gör att de snabbt kan börja oskadliggöra hoten och skicka varningssignaler till det adaptiva immunförsvaret. När en adaptiv cell, specialtränad för att känna igen just denna inkräktare, aktiveras börjar den klona fler kopior av sig själv och den samlade truppen ger sig sedan ut i kroppen för att bekämpa hotet.

Om det är något vi lärt oss av många års studier av sjukdomsframkallande bakterier är det att vi befinner oss i en ständig kapprustning, där det sällan är klart vem som har överhanden. Den här avhandlingen handlar om en del av denna kapprustning – hur bakterien Streptotoccus pyogenes (oftast kallad Grupp A Streptokocker (GAS)) använder sig av två vapen, så kallade virulensfaktorer, för att dämpa varningssignaler från makrofager, en del av det medfödda immunförsvaret.

GAS ger upphov till infektioner av väldigt olika karaktär, från milda sjukdomar såsom halsfluss och svinkoppor till de potentiellt livshotande (invasiva) infektionerna nekrotiserande fasciit (mer känd som köttätande sjukdom) och toxiskt chocksyndrom. Med en sådan bred sjukdomsrepertoar är det inte konstigt att GAS finns med i toppen på WHO:s lista över infektionsrelaterade dödsorsaker världen över. Som tur är går det fortfarande att behandla de flesta GAS-infektioner med antibiotika, men när det gäller de invasiva infektionerna är sjukdomsförloppet ofta för snabbt för att det ska hinna verka. Sedan 1980-talet har det skett en ökning i antal rapporterade fall av invasiva infektioner. Bakterier tagna från dessa patienter visade att många av sjukdomsfallen orsakats av en och samma bakteriestam som snabbt spridits världen över. Genom genetiska jämförelser av denna stam och äldre stammar har man kommit fram till att det som skiljer dem åt är bland annat att den nya stammen producerar mer av de två virulensfaktorerna Streptolysin O (SLO) och NADase.

Tidigare studier har visat att SLO kan döda makrofager genom att göra stora hål i dem, men makrofagerna kan å andra sidan upptäcka dessa hål genom ett varningssystem som kallas inflammasomen och snabbt utsöndra en signalsubstans, IL-1B, som lockar till sig andra celler ur immunförsvaret. Våra studier har visat att NADas kan minska mängden IL-1B som utsöndras, och att detta sker genom att NADas på något sätt hämmar en av makrofagens ytmolekyler som kallas P2X7. Vi har också sett att SLO kan göra så att IL-1B bryts ner inne i cellen istället för att utsöndras. IL-1B har tidigare visats spela en viktig roll i att dämpa GAS-infektioner, så att det var just den signalsubstansen som både SLO och NADas påverkade var väldigt intressant, eftersom det skulle kunna innebära att bakterien använder dem för att undgå att upptäckas av immunförsvaret. Vidare forskning i exakt hur SLO och NADas hämmar IL-1B kommer ge viktig information om infektionsförloppet i stort men också göra att vi fördjupar våra kunskaper om hur våra immunceller fungerar.