Molecular Mechanisms in Amyloid Disorders. Novel Treatment Options in Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopathy.

Forskningsoutput: AvhandlingDoktorsavhandling (sammanläggning)

Abstract

Popular Abstract in Swedish
Ett felaktigt protein som klumpar ihop sig i hjärnans blodkärl är orsaken till hjärnblödning och för tidig död hos unga islänningar. Sjukdomen är ärftlig och uppkommer på grund av en enda felaktig byggsten, orsakad av en mutation, i proteinet cystatin C. Det muterade proteinet bildar mikroskopiska proteinkedjor, fibriller, som klumpar ihop sig i bland annat hjärnans blodkärl. Detta leder så småningom till att blodkärlet spricker och det uppstår en hjärnblödning.
Med genteknik har den felaktiga genen hos islänningarna tidigare kopierats. En syntetisk version av genen har förts in i bakterier, som kan tillverka det muterade proteinet i laboratorieflaskor. Genom att i flera steg rena fram det isländska proteinet från bakterierna, är det möjligt att studera hur proteinet beter sig i lösningar som liknar kroppens egna. Dessa undersökningar har visat att proteinet bildar par genom att två proteinmolekyler hakar i varandra, så kallat domänutbyte. Samma domänutbytesmekanism, där flera molekyler hakar i varandra, ligger bakom bildandet av de långa proteinkedjorna, fibrillerna. Detta innebär att en substans som blockerar domänutbytet, skulle kunna användas i ett läkemedel för att förhindra fibrillbildning hos patienterna.
I ett av projekten som beskrivs i föreliggande avhandling, var målet att hitta substanser som verkar stabiliserande och förhindrar domänutbyte hos det muterade proteinet. Ett experimentellt system, där proteinet efter upprening försiktigt värmdes upp för att få proteinet att byta domäner och bilda par, provades noggrant ut. Proteiner är normalt sett känsliga för värme och det var en stor utmaning att hitta precis rätt förhållande för att driva på domänutbyte, utan att förstöra proteinet. Det finns ett obegränsat antal kemiska substanser som skulle kunna fungera, och det skulle ta oändligt lång tid att testa substanser en i taget. Därför var ett viktigt delmål att utforma ett testsystem där ett stort antal substanser kan testas samtidigt. Men det var mödosamt och tidskrävande att rena fram de mängder av proteinet som behövdes, och därför utvecklades ett snabbtest i miniatyrformat. För att testa om en substans, i det nya systemet, kunde blockera parbildning hos det muterade proteinet, krävdes endast två mikrogram cystatin C i en tiomikroliters portion. Detta gjorde det möjligt att gå igenom 1040 kända läkemedel för att se om de har någon stabiliserande effekt. Ett antal olika antikroppar testades också, och sammantaget hittades ett flertal kandidater som verkade stabiliserande. Dessa utvärderas nu ytterligare i andra experimentella system, för att de bästa substanserna skall kunna väljas ut.
Ett flertal andra obotliga sjukdomar, till exempel Alzheimers sjukdom och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom; det vill säga den mänskliga formen av galna ko-sjukan, orsakas av att proteiner, andra än cystatin C, bildar fibrillklumpar. Vid dessa sjukdomar, samt även vid isländsk hjärnblödning, har man i elektronmikroskop sett speciella ringformer, som uppträder före fibrillerna bildas. Dessa ringformer har visats vara mycket giftigare för celler än fibriller. Mellanformerna har dock varit svåra att undersöka, beroende på att de är flyktiga och inte låter sig isoleras. Med bristande kunskaper om de molekylära mekanismer som orsakar denna grupp av sjukdomar har inga verksamma läkemedel kunnat utvecklas. Eftersom domänutbytesmekanismen har konstaterats också vid Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, finns skäl att misstänka att samma eller snarlika mekanismer ligger bakom flera sjukdomar i denna grupp.
I en av studierna användes en designad genvariant av cystatin C som, i precis rätt kemisk miljö, kunde förmås att bilda stabila mellanformer. Det miniatyriserade testsystemet var här mycket användbart, eftersom ett stort antal kemiska förhållanden behövde prövas ut, innan de stabila mellanformerna kunde erhållas. Efter en framgångsrik uppreningsprocedur kunde mellanformerna undersökas gällande storlek, form och funktion. Alla mellanformer, vilka bestod av två, tre, fyra och tio länkade molekyler samt en ännu större form, visade sig ha bildats genom domänutbyte. Ingen av dem kunde bygga större former, eller fibriller, utan domänutbyte, och mellanformen som bestod av tio molekyler hade en tydlig ringform när den undersöktes i elektronmikroskop. De stabiliserade mellanformerna användes för att bilda antikroppar i kaniner. De antikroppar som erhölls var specifika för mellanformer och kunde, efter en särskild uppreningsprocedur, användas för att selektivt ta bort mellanformer av cystatin C i ett blodbaserat testsystem.
I ett tredje projekt studerades en egenskap hos cystatin C som är av betydelse för alla kategorier patienter, d.v.s. om halten av cystatin C i blod kan påvisa njursjukdom. I en grupp patienter, som skulle genomgå kirurgi, undersöktes om inflammation hos patienter påverkar halten av cystatin C i blodet, eller om halten till största delen beror på hur väl njurarna fungerar. Detta gjordes som ett led i att utvärdera om halten av cystatin C är ett användbart mått på njurfunktionen. Halten av cystatin C förändrades inte nämnvärt under observationsperioden och samvarierade inte med halten av någon av de fyra inflammationsmarkörerna som uppmättes. Alltså påverkar inte det inflammatoriska tillståndet hos en patient hur väl cystatin C fungerar som markör för njurfunktion.

Detaljer

Författare
  • Gustav Östner
Enheter & grupper
Forskningsområden

Ämnesklassifikation (UKÄ) – OBLIGATORISK

  • Farmakologi och toxikologi
  • Läkemedelskemi

Nyckelord

Originalspråkengelska
KvalifikationDoktor
Tilldelande institution
Handledare/Biträdande handledare
Tilldelningsdatum2013 sep 14
Förlag
  • Division of Clinical Chemistry and Pharmacology, Faculty of Medicine, Lund University
Tryckta ISBN978-91-87449-50-5
StatusPublished - 2013
PublikationskategoriForskning

Nedladdningar

Ingen tillgänglig data

Relaterad forskningsoutput

Gustav Ranheimer Östner, Veronica Lindström, Per Hjort Christensen, Maciej Kozak, Magnus Abrahamson & Anders Grubb, 2013, I : Journal of Biological Chemistry. 288, 23, s. 16438-16450

Forskningsoutput: TidskriftsbidragArtikel i vetenskaplig tidskrift

Visa alla (3)