PCR inhibition mechanisms in forensic DNA analysis

Projektinformation

Beskrivning

In forensic DNA analysis, the polymerase chain reaction (PCR) enables DNA
analysis of minute biological crime scene traces. PCR is an enzymatic reaction for amplification of specific DNA fragments involving both biochemical and
biophysical processes. The main analytical challenge is posed by the nature of the samples of interest. Crime scene samples are heterogeneous and often contain background matrices, e.g. PCR inhibitors that impair the limit of detection. The objective of the work described in this Doctoral thesis was to obtain a greater understanding of how relevant PCR inhibitors impact the PCR. The focus was to study PCR inhibition mechanisms using the DNA analysis techniques qPCR, digital PCR (dPCR) and massively parallel sequencing (MPS). The importance of applying a DNA polymerase-buffer system that is compatible with the sample matrix was shown through screening of 16 DNA polymerase-buffer systems for qPCR analysis of environmental samples containing humic substances. In dPCR, the tolerance to humic acid was elevated 48 times when an alternative DNA polymerase-buffer system was used. Also, a statistical Bayesian model was developed to provide an objective dPCR data analysis method. Detailed PCR inhibition mechanisms were elucidated for the main inhibitory molecules in blood and soil matrices. IgG binds to genomic single-stranded DNA, thereby hindering primer annealing and causing delayed amplification. Haemoglobin and its derivative haematin negatively impact the DNA polymerase activity. When studying the PCR inhibition mechanisms of humic acid using a robust DNA polymerase-buffer system, a new bottleneck in the analysis was identified. Namely, that humic acid causes fluorescence quenching, thus hindering amplicon detection. Further studies revealed that not only humic acid, but also haemoglobin causes static quenching of DNA-binding dyes. MPS is finding its way into forensic casework, due to the many opportunities that the technique offers. I could show that humic acid and haematin have a considerable negative impact on the multiplex PCR used to prepare the DNA for sequencing. Further, the inhibitor-tolerance of the state-of-the art MPS method is poor, but could be improved through the addition of BSA in the initial PCR. In summary, I have elucidated the PCR inhibition mechanisms of the relevant PCR inhibitors in soil and blood matrices. I have identified and characterized inhibitors affecting DNA polymerase activity, nucleic acids and fluorescence detection. The knowledge gained can be used for developing accurate and reliable DNA analysis methods for forensic DNA analysis as well as for other fields where challenging samples from surfaces or the environment are analysed.

Populärvetenskaplig beskrivning

När ett brott har begåtts är dna ett av de viktigaste bevismaterialen som säkras på brottsplatsen. Resultaten från en forensisk dna-analys används i rätten för att
bedöma om en misstänkt person är skyldig till brottet. Därför är det avgörande att metoderna som används för dna-analys är rationella och tillförlitliga. På Nationellt forensiskt centrum (NFC) i Linköping analyseras ungefär 60 000 dna-spår från brottsplatser varje år. En av de största utmaningarna är att proven ofta innehåller små mängder dna av dålig kvalité i kombination med analysstörande ämnen. För att kunna analysera svåra prover behövs ökad kunskap om såväl molekylära hämningsmekanismer som rationella analysmetoder som kringgår hämningen.

Tekniken som används för forensisk dna-analys kallas PCR (polymerase chain
reaction) och bygger på en biokemisk process som påvisar och mångdubblar
specifika dna-fragment i de kriminaltekniska proverna. I den här avhandlingen har en kombination av moderna tekniker för dna-analys och andra molekylära tekniker använts för att undersöka hur molekyler, s.k. PCR-hämmare, ifrån blod och jord mekanistiskt stör dna-analysen.

En av de viktigaste upptäckterna i mitt avhandlingsarbete är att för första gången i PCR-baserad analys visa hur särskilda molekyler från blod och jord slår ut ljussignalen som används för att detektera dna. Dessa molekyler är mer specifikt humussyror i jord samt hemoglobin i blod. Jag har även slagit fast att dessa molekyler stör uppkopieringen av dna:t genom att slå ut DNA-polymeraset, det enzym som används för att mångdubbla dna-fragmenten. Immunoglobulin G, en molekyl i blod, har en annan hämningsmekanism och stör genom att binda till enkelsträngat genomiskt dna.

Jag har också visat att valet av DNA-polymeras är avgörande för möjligheten att
generera pålitliga resultat från smutsiga prover. Ett alternativt DNA-polymeras
visades hantera 48 gånger mer PCR-hämmare än det enzym som normalt används.

En ny analysteknik som heter massiv parallellsekvensering (MPS) möjliggör en
bredare analys av dna i brottsutredningar. Tack vare sekvensanalysen kan man
erhålla mer genetisk information som kan användas för att förutsäga exempelvis
utseendedrag som hår- och ögonfärg samt nå längre i att skilja ut olika personers dna i blandningar. Jag har i mitt avhandlingsarbete studerat hur MPS påverkas av PCR-hämmare och kunde visa att dagens metod för MPS-analys av
brottsplatsprover är mycket känslig för hämmare. Jag kunde också fastslå att man kan kringgå denna MPS-hämning med samma strategier som för etablerad PCRanalys, bland annat via tillsats av ett specifikt protein. Vidare arbete behövs för att ta fram MPS-metoder som klarar att analysera utmanande prover.

De slutsatser som redovisas i denna avhandling har redan stärkt den forensiska
rutinanalysen på NFC. Bland annat har den framtagna kunskapen lett till att flera
analytiska flaskhalsar identifierats och att felsökning av analysproblem kopplat till PCR-hämning blivit effektivare. Avhandlingsarbetet har också förbättrat
diagnostisk dna-analys i områden som berör medicin, livsmedel och bioterrorism, exempelvis genom att optimera dna-analysen av sjukdomsskapande bakterier i miljöprover. Via fortsatta satsningar på verksamhetsnära forskning tror jag att vi i framtiden kommer att kunna analysera betydligt fler prover där dna-materialet p.g.a. ålder, låg mängd och hämmare idag omöjliggör analys. Det övergripande målet är att fler brott ska kunna lösas med hjälp av informativ och rationell dna-analys av svåra brottsplatsprover.
StatusSlutfört
Gällande start-/slutdatum2014/06/022019/05/24