Phage–derived Endolysins as Potential Antibacterials: A Study of Peptidoglycan Hydrolase and Mycolylarabinogalactan Esterase Enzymes

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect bacteria, at the end of their lytic cycle produce a set of enzymes called endolysins to lyse host cells from within facilitating the release of the viral progeny. Due to their lytic activity, endolysins have gained great interest as potential antibacterials targeting both Gram–positive and –negative bacteria, especially in the actual context of
increasing rates of antibiotics resistance. This approach relies on the observation that, external application of recombinant endolysins (enzybiotics) can efficiently lyse target bacteria from without. The current thesis explores the potential of two groups of endolysins, peptidoglycan hydrolase and mycolylarabinogalactan esterase as potential antibacterials. The peptidoglycan hydrolases hydrolyze glycosidic and amide bonds in the peptidoglycan layer of the bacterial cell wall, while mycolylarabinogalactan esterases hydrolyze the ester bond between mycolylarabinogalactan and peptidoglycan in mycobacterial cell wall. The current thesis approach was accomplished through development of novel strategies for immobilization, increasing the spectrum of activity, improving stability and characterization of novel enzymes. Different strategies for immobilization of the well–known peptidoglycan hydrolase, lysozyme from T4 bacteriophage and its
antibacterial activity was studied. Immobilization of the T4 lysozyme (T4Lyz) to wound dressing gauze in a single facile binding step was achieved through engineering the endolysin with a cellulose binding module (CBM) as a fusion tag. T4Lyz–CBM–immobilized gauze retained antibacterial activity against Gram–positive Micrococcus lysodeikticus (3.8 Log10 reduction) and Gram–negative Escherichia coli and Pseudomonas mendocina with 1.59 and 1.39 Log10 reduction, respectively. In another approach, the antibacterial activity and storage stability of the T4Lyz as well as Hen Egg White Lysozyme (HEWL)
were enhanced via covalent immobilization to tailored positively charged aminated cellulose nanocrystals (Am–CNC). Am–CNC–lysozyme conjugates retained muralytic activity of 86.3% and 78.3% for HEWL and T4Lyz, respectively. Am–CNC–T4Lyz conjugates also showed enhanced bactericidal activity with MIC (minimum inhibitory concentration) values of 62.5, 100, 500 and 625 μg/ml against M. lysodeikticus, Corynebacterium sp., E. coli and P. mendocina, respectively. The Log10 reduction of the tested bacteria occurred in a relatively shorter time as confirmed by time kill study using Alamarblue® as metabolic indicator dye. Transmission electron microscopy revealed altered membrane morphology of the cells treated with the conjugates. The immobilized preparations further exhibited enhanced storage stability at 4 and 22 °C.
The second part of the study dealt with lysin B (LysB), a mycolylarabinogalactan esterase produced by mycobacteriophages that infect mycobacterial cells, which possess a unique cell wall structure with a thick mycolic acid layer. In this work, the genome database of mycobacteriophages was explored to find and categorize LysB enzymes based on similarity to LysB–D29, the only LysB with available crystal structure. Comparative structural analysis of some novel mycobacteriophage LysB enzymes resulted in homology modeling of 30 LysB proteins different in their similarity to LysB–D29. Structure alignment showed that LysB enzymes are not true lipases due to the lack of the lid domain which was confirmed by testing the esterase activity of LysB–D29 against para–nitrophenyl butyrate (pNPB) in presence and absence of surfactant. Our results showed that unlike true lipases, LysB–D29 has higher enzymatic activity in the absence of Triton X–100 as a surfactant and hence doesn’t require interfacial
activation. Moreover, some LysB homologs with different degree of similarity to LysB–D29 were cloned and recombinantly expressed in E. coli BL 21 (DE3) expression host. Characterization of their kinetic parameters for the hydrolysis of para–nitrophenyl ester substrates showed LysB–His6 enzymes to be active against range of substrates (C4–C16), with a catalytic preference for para–nitrophenyl laurate (C12). Moreover, LysB–His6 enzymes have the highest catalytic activity at 37°C, and some divalent metal ions e.g. Ca2+ and Mn2+ enhance the catalytic activity. The mycolylarabinogalactan esterase activity for
hydrolysis of mycolylarabinogalactan––peptidoglycan complex as substrate for the LysB–His6 enzymes was confirmed by LC/MS. Extracellular application of LysB–His6 against Mycobacterium smegmatis resulted in marginal antibacterial activity. However, combining LysB–His6 enzymes with half MIC (1 μg/ml) of colistin (outer membrane permealizer) enhanced the antibacterial activity of LysB–His6 enzymes against M. smegmatis.

Mänsklighetens framgång och framsteg beror på dess förmåga att förebygga och bota sjukdomar. Den nuvarande spridningen av antibiotikaresistens ifrågasätter den framtida effekten av dagens antibiotika . Missbruk och överanvändning av befintliga antibiotika hade lett till utveckling av superbakterier som är resistenta mot nästan alla tillgängliga antibiotika. Katastrofala scenarier förutspås som leder till allvarliga mänskliga och ekonomiska förluster om vi inte lyckas hitta nya behandlingar, med tiotals miljoner dödsfall per år och kostnader som stiger till biljoner USD 2050. Dessutom är detta hot också förknippat med en mycket begränsad pipeline av nya effektiva terapier från läkemedelsindustrin. Därför krävs det snabbt nya antibiotika och alternativ. Ett av dessa alternativ är fag rellaterade enzymer som också kallas endolysiner. Fager, även kända som bakteriofager, finns i överflöd i naturen och betraktas som bakteriernas naturliga fiende och kan hjälpa oss att utrota patogena bakterier. De landar på ytan av en bakterie och injicerar sin egen genetiska kod. Detta kapar bakteriecellen och förvandlar den till en fag–fabrik, tills virusavkommorna så småningom sprids ut ur cellen, genom endolysiners verkan. Endolysiner som också kallas enzymbiotika (enzymbaserad antibiotika) används av bakteriofager i slutet av deras replikationscykel för att bryta ned peptidoglykan i bakteriecellväggen vilket resulterar i frisläppandet av den virala avkomman. Endolysiner verkar snabbt, framkallar inte resistens och är potenta (aktiva i en mycket låg koncentrationer). Trots deras effektivitet är endolysiner huvudsakligen aktiva mot grampositiva bakterier. Det höga lipidinnehållet i det yttre skiktet av både gramnegativa och mykobakterier skyddar dem från verkan av endolysiner vilket gör dessa ineffektiva. Därför utvecklas nya strategier för att utöka effekten av endolysiner mot gramnegativa och mykobakterier, till exempel bindning av endolysiner till skräddarsydda nanopartiklar eller användning av föreningar som destabiliserar det yttre skiktet vilket ger åtkomst för endolysinerna.
Denna avhandling ger exempel på olika tillämpningar av endolysiner med potentiell antibakteriell aktivitet. Av dessa, bindning av endolysin från T4–bakteriofag till ett sårförband, och testning av aktiviteten hos detta gasbinde–immobiliserade enzym mot olika bakterier. Samma enzym var också bundet till biologiskt nedbrytbara nanokristaller av cellulosa och användes för att döda både Gram–positiva och–negativa bakterier. Vi sökte också i databaserna för att identifiera och karakterisera nya endolysiner som kan verka på mykobakterier. Slutligen testas nya endolysiner från mycobacteriofager (fager som infekterar mycobacteria) för deras aktiviteter med potentiell modifiering för applicering mot den patogena Mycobacterium tuberculosis som orsakar TB; lungsjukdomen.