Transcriptional biomarkers of toxicity - powerful tools or random noise? An applied perspective from studies on bivalves

Aquatic organisms are constantly at risk of being exposed to potentially harmful chemical compounds of natural or anthropogenic origin. Biological life can for instance respond to chemical stressors by changes in gene expression, and thus, certain gene transcripts can potentially function as biomarkers, i.e. early warnings, of toxicity and chemical stress. A major challenge for biomarker application is the extrapolation of transcriptional data to potential effects at the organism level or above. Importantly, successful biomarker use also requires basal understanding of how to distinguish actual responses from background noise. The aim of this thesis is, based on response magnitude and variation, to evaluate the biomarker potential in a set of putative transcriptional biomarkers of general toxicity and chemical stress.
Specifically, I addressed a selection of six transcripts involved in cytoprotection and oxidative stress: catalase (cat), glutathione-S-transferase (gst), heat shock proteins 70 and 90 (hsp70, hsp90), metallothionein (mt) and superoxide dismutase (sod). Moreover, I used metal exposures to serve as a proxy for general chemical stress, and due to their ecological relevance and nature as sedentary filter-feeders, I used bivalves as study organisms.
In a series of experiments, I tested transcriptional responses in the freshwater duck mussel, Anodonta anatina, exposed to copper or an industrial waste-water effluent, to address response robustness and sensitivity, and potential controlled (e.g. exposure concentration) and random (e.g. gravidness) sources of variation. In addition, I performed a systematic review and meta-analysis on transcriptional responses in metal exposed bivalves to (1) evaluate what responses to expect from arbitrary metal exposures, (2) assess the influence from metal concentration (expressed as toxic unit), exposure time and analyzed tissue, and (3) address potential impacts from publication bias in the scientific literature.
Response magnitudes were generally small in relationship to the observed variation, both for A. anatina and bivalves in general. The expected response to an arbitrary metal exposure would generally be close to zero, based on both experimental observations and on the estimated impact from publication bias. Although many of the transcripts demonstrated concentration-response relationships, large background noise might in practice obscure the small responses even at relatively high exposures. As demonstrated in A. anatina under copper exposure, this can be the case already for single species under high resolution exposures to single pollutants. As demonstrated by the meta-regression, this problem can only be expected to increase further upon extrapolation between different species and exposure scenarios, due to increasing heterogeneity and random variation. Similar patterns can also be expected for time-dependent response variation, although the meta-regression revealed a general trend of slightly increasing response magnitude with increasing exposure times.
In A. anatina, gravidness was identified as a source of random variability that can potentially affect the baseline of most assessed biomarkers, particularly when quantified in gills. Response magnitudes and variability in this species were generally similar for selected transcripts as for two biochemical biomarkers included for comparison (AChE, GST), suggesting that the transcripts might not capture early warnings more efficiently than other molecular endpoints that are more toxicologically relevant. Overall, high concentrations and long exposure durations presumably increase the likelihood of a detectable transcriptional response, but not to an extent that justifies universal application as biomarkers of general toxicity and chemical stress. Consequently, without a strictly defined and validated application, this approach on its own appears unlikely to be successful for future environmental risk assessment and monitoring. Ultimately, efficient use of transcriptional biomarkers might require additional implementation of complementary approaches offered by current molecular techniques.

Organismer kommer i miljön i konstant kontakt med olika naturliga och konstgjorda kemikalier. Även om de i många fall är mer eller mindre ofarliga besitter alla kemikalier förmågan att, beroende på exponeringens intensitet, vara skadliga på olika sätt. Inom forskningsfältet miljötoxikologi finns det därför olika sätt att angripa frågor kring potentiella negativa effekter från kemikalier. Ett sådant sätt är att använda så kallade biomarkörer. Kortfattat är en biomarkör en utvald egenskap eller ett biologiskt mått som (1) kan mätas i eller på en organism, och (2) förändras antingen vid kontakt med kemikalier, eller till följd av oönskade effekter som uppstår. Eftersom många effekter först uppstår på cellnivå brukar olika typer av molekylära förändringar betraktas som möjliga biomarkörer för att förutse skadliga effekter på organismen.
Gener utgör bitar av biologisk information som bärs av alla organismer, och innehåller i regel instruktioner för att bilda proteiner med funktioner i cellen. Det första steget i genuttrycksprocessen kallas transkription och sker när en gen, d.v.s. en specifik sekvens av organismens DNA, kopieras till tillfälliga arbetskopior av sig själv, d.v.s. gentranskript som består av RNA. Dessa används i sin tur som mallar för att i cellen bilda det protein som motsvarar den specifika genen. Medan mängden DNA är konstant varierar nivåerna av olika gentranskript över tid beroende på organismens behov för tillfället. Vissa gener är till exempel kända för att ha skyddande funktioner mot kemiska stressfaktorer, varför de förväntas uttryckas i högre grad hos organismer som utsätts för kemisk stress. Genom att svara på exponeringar som riskerar att bli skadliga längre fram kan transkript av dessa gener betraktas som tidiga varningar innan dess att verklig skada uppstår.
I denna avhandling har jag undersökt sex utvalda stressgener och utvärderat huruvida deras gentranskript kan användas som generella biomarkörer för giftiga kemikalier. Närmre bestämt använde jag sötvattensarten allmän dammussla (Anodonta anatina) i en rad laboratorieförsök, för att undersöka hur gentranskriptionen påverkades dels av koppar, dels av ett industriellt utsläppsvatten. I dessa försök studerade jag hur känsliga och hur robusta gentranskripten var för att kunna fungera som generella biomarkörer. Dessutom genomförde jag en studie baserad på publicerad vetenskaplig litteratur, en så kallad systematisk översikt och metaanalys (eng. ’systematic review and meta-analysis’), för att besvara motsvarande frågor i större skala, d.v.s. rörande musslor och metaller i allmänhet.
Svarssignalerna hos gentranskripten var i regel både svaga och varierande, vilket begränsar möjlig användning som biomarkörer. Tillsammans tyder experimenten och metaanalysen på att vi inte nödvändigtvis kan förvänta oss detekterbara biomarkörsignaler enbart för att musslor utsätts för giftiga metaller. Jag påvisade i dammusslor att svarssignalerna generellt ökade vid högre halter av koppar, d.v.s. högre kemisk stress, men dessa samband syntes i regel inte i metaanalysen vid jämförelser mellan olika arter och metaller. Bakgrundsbruset var i allmänhet så högt att det riskerade att dölja biomarkörsignalen, även i de fall där genuttrycket faktiskt förändrades som svar på kemikalierna. Sammantaget kan slumpmässig variation, både inom och mellan arter och exponeringar, troligtvis begränsa förmågan att detektera biomarkörsignaler.
En av flera möjliga källor till variabilitet i dammusslor var graviditet. När musslorna är gravida, vilket i naturen äger rum från sensommar till tidig vår, kan bakgrundsbruset förväntas öka hos de flesta av mina undersökta biomarkörer. Detta gällde dock inte enbart gentranskript. För att sätta transkripten i ett vidare perspektiv undersökte jag även två ytterligare biomarkörer baserade på enzymaktivitet. Jämfört med transkripten påvisade dessa en liknande grad av variabilitet och liknande svarssignaler, både överlag och med särskilt avseende på graviditet. Å ena sidan kan detta tolkas som att de utvalda gentranskripten varken är väsentligt bättre eller sämre än etablerade biomarkörer på att detektera kemisk stress. Å andra sidan finns det i så fall heller ingen fördel med att använda transkript som biomarkörer, jämfört med molekylära förändringar som är enklare att tolka ur ett toxikologiskt perspektiv.
Sammanfattningsvis skulle tydliga biomarkörsignaler möjligtvis kunna förväntas under specifika och validerade försöksförhållanden (t.ex. försök som utesluter gravida musslor, eller riktar sig mot specifika arter och kemikalier), särskilt vid höga koncentrationer och/eller längre perioder av exponering. I praktiken är dock förhållandena för miljöövervakning och -riskbedömning sällan optimala, vilket begränsar allmängiltigheten hos dessa markörer. Sammantaget kan det bästa sättet för att implementera gentranskript i framtida miljöriskbedömning visa sig bli en kompletterande användning av validerade biomarkörer, modeller som knyter gentranskript skadliga effekter på organismen, och tekniker som tidigt kan detektera förändringar i organismens övergripande transkriptionsmönster.