Not all those who wander are lost: A study of cancer cells by digital holographic imaging, fluorescence and a combination thereof

Cancer är den näst vanligaste dödsorsaken i världen idag och en tredjedel av Sveriges befolkning blir diagnosticerade med cancer under sin livstid. Av alla cancerfall i Sverige, så är prostatacancer den vanligaste och bröstcancer den näst vanligaste, medan hos enbart kvinnor så är bröstcancer den vanligaste med 29,2 % av cancerfallen. Överlevnaden efter en cancerdiagnos har i Sverige ökat sedan 70-talet från 48 till 74 % för kvinnor och 35 till 75 % för män. Majoriteten av alla dödsfall i cancer beror inte på den primära cancern, utan på metastaser som spridit sig till andra delar av kroppen.

Under senare år har forskare förstått att de celler som startar tumörer och metastaser är en speciell typ av cancerceller, vilka har karakteristiska drag som gör att de liknar normala stamceller. Därför kallas den här typen av cancerceller för cancerstamceller. För normala stamceller är överlevnad en av de viktigaste funktionerna, vilket också har visat sig stämma för cancerstamcellerna. Vid behandling av tumörer, med många av de läkemedel som används idag, så dör inte cancerstamcellerna eftersom de har speciella strategier för att överleva även under förhållanden där övriga cancerceller dör. Därför måste nya läkemedel utvecklas. Dessa nya läkemedel måste designas för att vara mer effektiva mot cancerstamceller, samtidigt som de inte är för giftiga mot vanliga friska celler.

Cancerstamcellerna vill gärna bryta sig loss från den primära tumören och genom blodsystemet eller lymfkärlen transportera sig till andra delar i kroppen för att bilda nya tumörer, metastaser. Därför är en strategi i utvecklingen av nya cancerläkemedel att göra cellerna mindre benägna att röra sig. Ett sådant läkemedel är salinomycin. Denna substans används idag som antibiotika inom köttindustrin, men vid en genomgång av 16000 substanser urskilde sig salinomycin genom att vara mer än 100 gånger så effektivt mot cancerstamceller som ett av dagens cancerläkemedel, paclitaxel. Många forskargrupper har undersökt effekten av salinomycin och det har visat sig att denna substans bland annat förändrar cancercellerna från att vilja röra sig, till att hellre vara still bland andra celler. Samtidigt har forskare också sett att vid behandling med salinomycin, så minskar andelen cancerstamceller. Vi har i vår forskning visat att denna minskning beror på att cancerstamcellerna slutar dela sig mer än vad icke-stamcellerna gör efter behandling med salinomycin.

Inom cancerforskning, men även inom mycket annan forskning, så kan forskningsmetoden baseras på celler, försöksdjur eller datormodeller. Ofta finns dessa olika forskningsmetoder med för att komplettera till varandra. Vi har i detta projekt använt enbart celler, vilka vi analyserat med hjälp av nya mikroskopiska metoder. Vi vill med detta projekt inte bara utvärdera effekter på cancerceller när vi behandlat dem med salinomycin, utan vi vill också utvärdera vilka metoder som forskare kan använda. Nya metoder kan leda till bättre resultat från den cellbaserade forskningen och tillsammans med datormodeller kan de då på sikt ersätta djurförsök för en mer etisk forskning, men också för att ge bättre resultat i forskningen.

Mikroskoperingsmetoden som vi baserat detta arbete på kallas digital holografi. Bilden i digital holografi är en datorgenererad bild. Den görs med hjälp av en laser, vilken delas i två identiska strålar. Ena strålen går igenom provet med cellerna och den andra går bredvid provet. Sedan blandas strålarna med varandra på en kamera, och datorn kan räkna ut en bild av cellerna i provet. Denna bild är tredimensionell och i den går det att mäta hur cellerna ser ut både i två och tre dimensioner. Lasern har låg intensitet och är ofarlig för celler och därför går det att använda denna mikroskoperingsteknik för att studera celler över lång tid utan att påverka dem. Vi har använt mikroskopet till att ta bilder på samma celler var femte minut i 24 till 72 timmar. Cellerna i bilderna har vi sedan följt genom hela tidsintervallet. Vi har då kunnat kartlägga hur cellerna delar sig samt rör sig under denna tid. Metoden ger oss möjligheten att se hur varje individuell cell beter sig, vilket är bra eftersom vi vet att cancerstamceller kan vara en väldigt liten del av alla celler. Med de vanliga metoderna som ofta används så analyseras alla celler samtidigt och på samma sätt. Det finns då en risk att beteende och effekter på få celler göms i all data och viktig information förloras.

Genom att följa varje individuell cell har vi kunnat hitta små grupper av celler som har haft avvikande beteende. När vi behandlade med salinomycin hittade vi ett fåtal celler som fortsatte dela sig efter 48 timmars behandling. När vi jämförde med en metod där alla celler analyseras så kunde vi konstatera att denna effekt var helt osynlig där. Vidare så har vi även analyserat hur celler delar sig och rör sig på olika ytor. Dessa ytor är tänkta att användas för att mäta hur mycket kraft celler använder när de drar sig framåt, eftersom det visat sig att celler som bildar metastaser drar hårdare i underlaget. Det vore därför bra med en enkel metod för att mäta detta. Det vi upptäckte när vi följde cellerna på denna yta var att en del av cellerna var kraftigt påverkade av själva ytan. De slutade dela sig och slutade röra sig. Detta är viktigt att veta, för de forskare som vill använda denna typ av yta för att mäta hur mycket kraft celler använder. De behöver då förstå att inte alla celler trivs på ytan och därmed riskerar de att mäta på bara en viss typ av celler.

Celler har proteiner och andra typer av molekyler på utsidan av sitt cellmembran. De här molekylerna kan vara generella och finnas på många olika typer av celler, eller också specifika och finnas speciellt på vissa celler. Den här typen av protein används bland annat för att identifiera cancerstamceller. Genom att använda antikroppar, som är designade att binda till specifika proteiner, och som har en färgad molekyl på sig går det att identifiera vilka celler som har proteinet på sitt membran och vilka som inte har det. Det är sedan tidigare känt vilka proteiner som ska undersökas på de celler som vi använder, för att identifiera om de är cancerstamceller eller inte.

För att kunna se den färgade molekylen, fluoroforen, behövs ett mikroskop med ljus speciellt designat för att se just den. I digital holografi finns inte sådant ljus och det går därför inte att se denna typen av molekyler med bara digital holografi. Vi kan därför inte identifiera de celler som beter sig annorlunda i våra experiment. För att kunna det designade vi en experimentell uppställning där vi kombinerade digital holografi med ett fluoresensmikroskop. Efter bildtagningen i digital holografi, flyttade vi provet till det andra mikroskopet och tog bilder på samma plats. Bilderna matchades sedan för hand och det gick att se om cellerna vi följde var cancerstamceller eller inte. Det var på det sättet vi kunde se att salinomycin påverkade celldelningen hos cancerstamceller.

Genom detta projekt har vi kunnat visa nya cellbaserade metoder för att utvärdera effekter på celler, både efter behandling med olika substanser och efter att cellerna växt på olika material. De effekter vi hittat har många gånger varit omöjliga att se vid användandet av mer vedertagna metoder, eftersom effekterna enbart påverkat få celler. Detta visar hur viktigt det är att ständigt utveckla metoderna vi använder vid forskning, för att ständigt förbättra och utöka vår kunskap om sjukdomar och hur vi kan behandla dem.