Phagocytosis by neutrophils - studies on phagosome dynamics and membrane traffic modulation by Streptococcus pyogenes

Popular Abstract in Swedish
Hur lurar mördarbakterier våra celler?

Neutrofiler och fagocytos räddar liv
Utan vårt immunförsvar så skulle vi snabbt dö i infektioner från mikroorganismer. Det består ett
komplicerat system av celler och molekyler som tillsammans kan klara av att stå emot attacker från
bakterier, virus, svampar eller parasiter. Cellerna i immunförsvaret utgörs av vita blodkroppar
och den sort som det finns flest av är neutrofilen. Neutrofilen är en av våra ätarceller och har
som sin främsta uppgift att snabbt leta reda på farliga organismer, som t ex sjukdomsalstrande
bakterier och sen döda dem genom att äta upp dem. Denna process kallas fagocytos och inleds
med att molekyler på neutrofilens yta känner igen molekyler på bakteriens yta. Detta utlöser en
signaleringskaskad inuti neutrofilen som tills slut leder till att delar av cellmembranet omsluter
bakterien och knoppas av som en blåsa inåt i cellen; då har en fagosom bildats. Till fagosomen
skickas därefter en stor mängd farliga substanser för att döda bakterien och bryta ner den. Det
praktiska med en membranblåsa som fagosomen är att det som är farligt hålls isolerat för att inte
skada neutrofilen och omgivningen. I de allra flesta fall dödas bakterier snabbt och effektivt av
våra neutrofiler, men det finns undantag.

Streptokocker kan lura neutrofiler
Grupp A streptokocker, eller på latin Streptoccus pyogenes, är en våra vanligaste sjukdomsalstrande
bakterier och orsakar många sjukdomar, däribland halsfluss, scharlakansfeber och rosfeber. De
kan också orsaka väldigt allvarliga tillstånd som STSS (streptococcal toxic shock syndrome) och
nekrotiserande fasciit. Det sistnämnda är anledningen till att kvällstidningarna ofta benämner
dessa bakterier för “mördarbakterier” eller “köttätande bakterier”. Under de senaste åren har
det visat sig att dessa bakterier har mekanismer för att kunna överleva fagocytos av neutrofiler.
Eftersom neutrofilerna ofta är först på plats och äter upp bakterierna, så innebär det att
streptokockerna är skyddade från ytterliggare angrepp av immunförsvaret så länge de kan klara
sig i neutrofilerna.

Min avhandling handlar om att på molekylär nivå karakterisera hur S. pyogenes kan klara
av att bli uppätna av våra neutrofiler. Mycket av min doktorandtid har handlat om att
utveckla metoder för att kunna studera detta, vilket har lett till Arbete 1 och Arbete 2. De två
återstående arbetena beskriver nya fynd om hur neutrofilen fungerar under fagocytos (Arbete
3) och hur streptokocker kan påverka neutrofilen efter att ha blivit uppätna (Arbete 4). Dessa
arbeten sammanfattas nedan.

Verktyg 1 – Använda cancerceller och cancerbehandling för att studera neutrofiler
I Arbete 1 har vi visat att leukemi-celler kan användas som modell-system för att studera
fagocytos av S. pyogenes. Cancerceller kan under rätt betingelser leva hur länge som helst genom
att de delar sig hela tiden. Det är också det som är problemet med sådana celler i människor och som behandling finns det ibland medel som kan hindra dem från att dela sig. Vi har använt oss av leukemi-celler (HL-60) härstammande från en kvinna på sjuttiotalet och gett dessa en sådan celldelningshämmande substans, som är en variant av A-vitamin. Det som händer då är att de omogna HL-60 cellerna börjar mogna och bli mer och mer lika neutrofiler och därmed kan användas för att studera fagocytos.

Verktyg 2 – Skapa magnetiska bakterier för att isolera fagosomer
Det är en stor fördel att kunna analysera enbart fagosomer och på så sätt få reda på vilka ämnen
som samlas eller försvinner under tiden en bakterie befinner sig där. För att kunna göra detta med
bakterier visade det sig att det behövdes nya verktyg och den största delen av min doktorandtid
har bestått av att utveckla en ny metod för att isolera fagosomer. I Arbete 2 har vi visat att det
går att fästa in nanometer-stora magnetiska partiklar på ytan av bakterier. Med hjälp av detta
har vi sedan lyckats med att magnetiskt rena fram intakta bakterie-innehållande fagosomer från
neutrofiler. Detta kommer troligtvis att vara till stor glädje för forskningsfältet och har redan lett
till ökad förståelse kring hur fagocytos-processen fungerar i neutrofiler (se nedan).

Fynd 1 – Nya mekanismer för leverans av anti-bakteriella substanser till
fagosomer
När en neutrofil äter en bakterie och börjar skapa en fagosom så startar direkt en väldigt
omfattande förflyttning av andra membranblåsor (vesiklar och granula) som innehåller bl a
bakteriedödande ämnen. När dessa granula smälter samman med fagosomen möjliggör det
att neutrofiler kan döda och bryta ner bakterier. De mekanismer som styr sådan leverans till
cellytan (tidig fas) har i många fall antagits vara de samma som de till fagosomen (sen fas). I
Arbete 3 har vi genom att bl a använda vår metod för att isolera fagosomer funnit att leverans
av granula-innehåll skiljer sig åt om man jämför tidig och sen fas. Vi har visat att detta regleras
av olika mekanismer där leverans under den tidiga fasen är beroende av kalcium och vissa
membranstrukturer; leverans till fagosomen är däremot oberoende av dessa faktorer.

Fynd 2 – Streptokocker stör pH-mekanismer i fagosomen efter att ha blivit uppätna av neutrofiler
Koncentrationen av vätejoner, dvs pH, är centralt för hur en fagosom fungerar. Det är väldigt
svårt att studera, då man inte kan fixera vätejoner och de snabbt diffunderar i vätskor. För att
undersöka hur det ser ut i bakterie-innehållande fagosomer så har jag i Arbete 4 använt mig av
avancerad digital mikroskopi. Intensiteten på ljuset från vissa fluorescenta molekyler varierar
med pH. Genom att fästa sådana till bakterieytan och sedan fånga det fluorescerande ljuset med
en digital kamera går det med bildanalys att omvandla ljusintensiteten till pH-värden. Med hjälp
av ett specialutrustat mikroskop går detta att göra på neutrofiler som håller på att äta bakterier
och därmed mäta pH direkt i fagosomen. På detta sätt har jag kunnat visa att S. pyogenes hämmar
inflödet av vätejoner i fagosomen (och därmed håller pH högt) genom att förhindra leveransen
av vätejons-pumpar.