Separation Methods in Membrane Proteomics -Integration of Aqueous Two-Phase Partitioning for Enrichment and Pre-Fractionation

Popular Abstract in Swedish
Allt eftersom fler och fler organismers totala uppsättning gener, genomet, sekvenseras ökar fokus på att kartlägga de genprodukter, proteiner, som uttrycks. Att kunna studera de proteiner som uttrycks mer eller mindre vid olika tidpunkter eller cellulära tillstånd utgör en viktig del i sökandet efter kunskap om biologiska och medicinska processer. Studier av den totala uppsättningen av proteiner, proteomet, som uttrycks av ett genom kallas för proteomik. Proteomik delas ofta in i tre övergripande delar: separation, identifiering och kvantifiering av de ingående proteinerna. Den traditionella metoden för proteinseparation är två-dimensionell gelelektrofores och för identifiering används masspektrometri och bioinformatik. Två-dimensionell gel-elektrofores, där proteiner separeras enligt laddning i första dimensionen och enligt storlek i andra dimensionen, utgör ett viktigt redskap för studier av den vattenlösliga delen av ett proteom och är med sin höga kapacitet för separation av komplexa proteinblandningar en hörnsten inom proteomik-forskning. Dock kan denna metod inte separera alla olika sorters proteiner som ingår i ett proteom och att finna och utveckla alternativa separationsmetoder för att inkludera proteiner från alla klasser för en fullständig blick över de biologiska processer som utförs i cellen.

Denna avhandling adresserar problemet med en stor och viktig del av proteomet, nämligen separation av membranproteiner. Membranproteiner utgör ungefär en trdjedel av proteomet och utför en rad vitala processer i cellen såsom att upprätthålla nivån av viktiga ämnen inuti cellen, ta emot signaler från sin omgivning genom receptorproteiner i membranet och dessutom generera en stor del av cellens energi. Om fel inträffar i dessa processer blir resultatet att cellens prestationsförmåga försämras med sjukdom som följd. Det faktum att ~70% av idag kända målmolekyler för läkemedel utgörs av membranproteiner understryker vikten av att kunna studera dem i detalj för att finna fler och effektivare läkemedel i framtiden.

I denna avhandling har fokus varit på anrikning och förberedande uppdelning av membranproteiner inför högupplösande separation, identifiering och kvantifiering. En specifik fraktioneringsmetod som använts i olika utföranden är fördelning av proteiner i vattenhaltiga tvåfas-system. Denna metod är baserad på att strukturellt olika komponenter separerar till distinkta faser om de blandas i tillräckliga koncentrationer. Partiklar kan sedan distribueras mellan dessa två faser framför allt beroende på yt-egenskaper såsom laddning, hydrophobicitet, eller specifik affinitet. Med hjälp av sådan fördelning kan anrikning av målmolekylen ske genom avskiljning från det oönskade materialet. Anrikning av membraner och membranproteiner i just sådana tvåfassystem kombinerat med en rad olika tekniker för hög-upplösande separation och identifiering har här studerats.

Då membranproteiner inte är lösliga under traditionella betingelser krävs amfifila kemikalier, detergenter, för att extrahera dem från den hydrofoba miljön i det inre av membranen och hålla dem lösliga under vattenbaserade förhållanden (solubilisering). Vikten av att undersöka experimentella förhållanden vid solubilisering visades genom att studera fem olika detergenter. Effektiv solubilisering kunde uppnås vid optimal detergentkoncentration i förhållande till mängden protein i lösningen. Denna solubilisering visade sig också vara kompatibel med efterföljande anrikning i vattenhaltiga tvåfassystem bestående av en detergentfas och en polymerfas. Många detergenter kan användas för att bilda tvåfassystem med olika polymerer vilket har utnyttjats för att anrika membranproteiner i den hydrofoba detergentfasen genom att avlägsna vattenlösliga proteiner till polymerfasen. Här visas också att denna fördelning går att justera genom att introducera laddningar till tvåfassystemet vilket resulterar i en elektrostatisk repulsion av negativt laddade vattenlösliga proteiner till polymerfasen och därmed en större anrikning av membranproteiner i detergentfasen. Den optimerade solubiliseringen tillsammans med detergent/polymer tvåfasfördelning utgör en mild strategi för anrikning av membranproteiner och membranproteinkomplex bestående av både hydrofoba och hydrofila komponenter.

Fördelning i vattenhaltiga tvåfassystem har även använts för anrikning av intakta membraner. Affinitet användes för att selektivt fördela bakteriella membraner i tvåfassystem bestående av två polymerer. Ett membranbundet transportprotein modifierades genetiskt för att uttrycka en extra aminosyrasekvens som kan användas för upprening med hjälp av metallaffinitet. Genom att fördela allt material till överfasen för att sedan sätta till affinitetsligander bundna till en gelmatris och selektivt omfördela de önskade membranen till underfasen kunde en anrikad fraktion uppnås.

I en inledande studie av patienter med björkpollenallergi användes tvåfas-fördelning för att isolera en upprenad fraktion cellmembraner från en blandning av immunceller. Ett antal kända ytmarkörproteiner kunde identifieras och en strategi baserad på fyra steg, där tvåfasfördelningen utgör ett, kunde postuleras. Preliminära resultat visar att ett antal potentiellt unika markörpeptider kan detekteras som kan användas för att kvantifiera olika ytspecifika proteiners uttryck i samband med pollensäsong. Sådana kunskaper kan sedan användas för att finna förklaringar till de processer som utgör allergisk respons och hur cellen svarar på behandling med potentiella botemedel.

Sammantaget så visar resultaten som presenteras i denna avhandling på att fördelning i vattenhaltiga tvåfas-system är en lämplig metod för initial anrikning av membraner och membranproteiner inom framtida proteomstudier.